中文题名哮喘患者支气管肺泡灌洗液中肥大细胞功能特性的研究
外文题名论文作者谢华
导师于润江
学科专业内科学
研究领域\研究方向
学位级别博士
学位授予单位中国医科大学
学位授予日期2002
论文页码总数139页
关键词支气管哮喘肥大细胞哮喘
馆藏号BSLW
中文摘要
实验材料和方法
一实验材料：茶碱腺苷、腺苷衍生物、离子载体钙型胶原酶、型透明质酸酶、青霉素和链霉素、牛血清白蛋白、含25mMHEPES的MEM、绵羊抗鼠免疫球蛋白、extr-抗生物素蛋白过氧化物酶和o-苯二胺(OPD)均由Sigma公司购得，山羊抗人IgE抗体、组胺酶联免疫试剂盒购于Serotec公司。
二、实验方法
1同意行支气管肺泡灌洗液检查的29名稳定期轻度支气管哮喘患者参与了本研究。
2BALF肥大细胞激发试验：将经光学纤维支气管镜回收的BALF用消毒过的尼龙滤器过滤，并用含2小牛血清的缓冲液冲洗两次。在取出10l进行细胞计数后，剩下的细胞再重新悬浮于含钙、镁离子缓冲液中。激发过程在LP试管中完成，即在预先加完50l抗IgE抗体CI、腺苷、腺苷衍生物(NECA)、缓冲液或抗IgE抗体+腺苷、抗IgE抗体+茶碱、腺苷+茶碱的试管中分别加入100l细胞悬液，并在37水浴箱中培养20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加入l00l冷缓冲液，并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于-20冻存。
3BALF肥大细胞组胺测定：采用组胺酶联免疫反应试剂盒来检测。其检测方法以100l的标准品、对照品或标本与50l的酰化溶液混匀后，在室温下反应1小时取50l酰化后的标准品、对照品或标本加入到已包被过抗体的96孔盘内，再于每孔内加入200l酶标物并在4条件下培养18小时。洗盘后加200l底物显色，然后用酶标仪以410nm光波长读盘。
4组织中肥大细胞的分离和激活：手术切除的经病理证实大体正常的肺或大肠组织切成小块放入含型胶原酶和型透明质酸酶的消化液中在37摇动水浴箱中分别培养60分钟和70分钟。悬浮的细胞通过滤过器(孔径100M)与未消化的组织碎片分离，然后放入含10小牛血清的培养液中于室温下培养16小时。悬浮的细胞经不含钙、镁离子的缓冲液冲洗两次后，再重新悬浮于缓冲液中。激发过程在LP试管中完成，即在预先加完50p1抗IgE抗体、CI或缓冲液的试管中加入100l细胞悬液，并在37水浴箱中培养20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加入150l冷缓冲液，并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于-20冻存。
5组织中肥大细胞的组胺测定：用以玻璃纤维为基础的荧光方法测定细胞悬液中的组胺水平。
6类胰蛋白酶水平测定：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法以抗类胰蛋白酶血清为抗进行铺盘，并置于4条件下过夜。用3BSA阻断非特异性蛋白质结合位点后，OByrne医生及其同事认为，尽管嗜酸性粒细胞与哮喘的气道炎性反应关系密切，但是肥大细胞和嗜碱性粒细胞同样具有重要作用。研究人员选取19名过敏性哮喘患者作为实验加人类胰蛋白酶标准品或待测样品每孔50l。以抗类胰蛋白酶单克隆抗体为识别抗使之与标准品或待测样品中的类胰蛋白酶结合，并以生物素结合的羊抗鼠免疫球蛋白为抗与extr-抗生物素蛋白过氧化物酶结合。最后用o-苯二胺显色并用酶标仪以490nm光波长读盘。
7统计学方法：全部统计分析均采用软件。数据以来表示P005为统计学上有显著差异。
1在哮喘患者BALF中，加入抗IgE抗体浓度低至001时即可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放211的组胺，而非哮喘者肺和大肠中1的抗IgE抗体浓度仅诱导189的组胺。将抗IgE抗体浓度从001增加到3对哮喘患者BALF中肥大细胞的组胺释放量无明显影响。
本实验抗IgE抗体对哮喘和非哮喘患者肥大细胞分泌组胺影响的敏感性截然不同，与之相对应本实验哮喘患者BALF中的肥大细胞对CI刺激的反应与非哮喘者肺和肠的反应相似，甲醛致肥大细胞DNA损伤与诱发哮喘作用关系的初步研究--公共卫生与预防医学2007年02期本文献来源中国知网目的研究甲醛致P815细胞DNA的断裂作用和例如1mol/L浓度的CI可分别引起408及398的组胺释放。腺苷浓度达100mol/L时仍无明显刺激组胺释放的作用，仅在浓度高达1000mol/L时方可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放约17的组胺。NECA的作用与腺苷相似。
2哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶的研究发现：抗IgE抗体在1/3000和1/1000两个浓度对哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶影响不大，当浓度在1/300以上时可起明显的促进作用CI的三个浓度均可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶。腺苷浓度在1mol/L以下对哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶影响不大，肥大细胞稳定剂当浓度在10mol/L以上时可起明显的促进作用NECA浓度从均可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶。
3在IgE抗体与腺苷联合作用对哮喘患者BALF中肥大细胞释放组胺影响的研究中发现：浓度为300nmol/L和1mol/L的腺苷仅引起哮喘患者BALF中肥大细胞释放约3的组胺，抗IgE抗体浓度在1/10000以上则对哮喘患者BALF中肥大细胞释放组胺有明显的促进作用，抗IgE抗体浓度在1/30000则作用不明显，但该浓度的抗IgE抗体与2种浓度的腺苷联合作用于哮喘患者BALF中，肥大细胞与相应的两种刺激剂单独作用数值的相加相比数值明显增加。腺苷与其它浓度的抗IgE抗体联合作用与相应的两种刺激剂单独作用数值的相加相比数值变化则不明显。
4在茶碱对哮喘患者BALF中肥大细胞释放组胺影响的研究中发现：浓度为1mol/L的腺苷与茶碱联合作用后可略降低腺苷的促进作用抗IgE抗体浓度在1/10000可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放组胺，与茶碱联合作用能降低约4的组胺释放。
1哮喘患者BALF中的肥大细胞对IgE依赖性刺激的敏感度增高到令人出乎意料的程度，与非哮喘者肺或大肠的悬浮肥大细胞相比，哮喘患者BALF中肥大细胞对抗IgE抗体刺激的敏感性至少要高出100倍。在抗IgE浓度低至001时仍可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放约20的组胺，而非哮喘者要达到相似程度的组胺释放至少需要1的抗IgE抗体浓度。这强有力地支持了肥大细胞激活是哮喘发病机制中的重要环节这一观点。这种被增强了的敏感性使哮喘患者在接触很低水平的抗原时即可出现哮喘发作，而正常个体却无反应。
与肥大细胞对抗IgE抗体的敏感性异常增高形成鲜明对比的是，哮喘患者BALF中的肥大细胞与非哮喘者肺和肠中的肥大细胞对CI刺激的反应相似，CI浓度在1M时可引起大约40的组胺释放。对CI刺激的良好反应表明Ca内流也是BALF中肥大细胞激活-分泌偶联的主要环节。肥大细胞
本研究发现哮喘患者BALF中腺苷在浓度达100M时仍无明显刺激组胺释放的作用，仅在浓度高达1000M时方可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放166的组胺。与先前报告腺苷为BALF中肥大细胞激活的相对有效的刺激剂不符。这可能是由于试验对象不同的结果，因为本研究对象为哮喘患者，而先前的报告为正常者。NECA的作用与腺苷相似。
2类胰蛋白酶是肥大细胞分泌的一种酶，研究证实其为肥大细胞活化的一个标志物。本研究发现抗IgE抗体在1/3000和1/1000两个浓度对哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶的影响不大，当浓度在1/300以上时可起明显的促进作用，核肥大细胞CI的三个浓度均可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶，较高浓度的抗IgE抗体和CI均可刺激哮喘患者BALF中的肥大细胞分泌类胰蛋白酶，说明了通过IgE依赖方式和Ca内流方式，哮喘中肥大细胞均可分泌类胰蛋白酶。
腺苷浓度在1mol/L以下对哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶的影响不大，当浓度在10mol/L以上时可起明显的促进作用，目的研究哮喘与非哮喘中肥大细胞脱颗粒方法29名轻度哮喘患者参加了本项研究支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞经冲洗后,加入抗IgE抗体或CI或缓冲液的试管中进行激发NECA浓度从均可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶，提示哮喘时肥大细胞激活后分泌的腺苷可反过来促进类胰蛋白酶的分泌，腺苷和类胰蛋白酶相互作用促进支气管收缩。
3关于抗IgE抗体和腺苷联合作用的研究发现：1/30000的抗IgE抗体单独作用不明显但该浓度的抗IgE抗体与2种浓度的腺苷联合作用于哮喘患者BALF中肥大细胞与相应的两种刺激剂单独作用数值的相加相比数值明显增加。说明低浓度的抗IgE抗体和腺苷有协同作用。
腺苷与其它浓度的抗IgE抗体联合作用与相应的两种刺激剂单独作用值相加的数值比较则变化不明显。这与先前有报告示腺苷与抗IgE抗体联合作用强于抗IgE抗体单独作用不符，这可能是因为试验对象不同的结果，因为本研究对象为哮喘患者，而先前的报告为正常者。
4本研究应用茶碱和300nmol/L、1mol/L两种浓度的腺苷或1/10000的抗IgE抗体联合作用于哮喘患者的BALF中的肥大细胞，发现与1mol/L的腺苷或1/10000的抗IgE抗体联合应用组，其肥大细胞分泌的组胺量均有下降，无论是肥大细胞与哮喘的关系,还是气道平滑肌收缩在哮喘中的重要性均早已为人们所认识。然而传统观点中气道平滑肌只是对各种炎症介质的被动效应细胞近年来,肥大细胞与300nmol/L的腺苷联合作用与该浓度腺苷单独作用变化不大，考虑可能和腺苷浓度较低有关。
茶碱与腺苷或抗IgE抗体联合作用后，其肥大细胞分泌的组胺量均有所下降可能茶碱具有抑制肥大细胞分泌组胺的作用。肥大细胞增生症即茶碱通过抑制哮喘中肥大细胞分泌介质而起治疗哮喘的作用。
哮喘患者肥大细胞的功能特性为：甲醛DNA损伤DPC单细胞凝胶电泳哮喘甲醛致肥大细胞DNA损伤与诱发哮喘作用关系的初步研究邓艳梅杨光涛摘要：目的研究甲醛致P815细胞DNA的断裂作用和致DNA在BALF中肥大细胞对IgE依赖性刺激比非哮喘者更敏感。
外文摘要肥大细胞增生支气管哮喘是一种由嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞和细胞因子参与的气道哮喘反复发作者可有抑郁焦虑、性格改变和社会适应能力下降的表现，应多采用鼓励性
