痰液癌基因突变的检测在诊断中的应用
中华结核和呼吸感染1998年第4期第0卷论著
作者：王翎王光杰夏学鸣马家用王晖张炜
单位：215006苏州，苏州院附属第一医院呼吸科
关键词：痰液肺肿瘤癌基因
摘要目的从分子生物学检测角度来寻求敏感的肺癌诊断新方法。方法应用多聚合酶链反应(PCR)结合限制性长度片段多态性分析法(RFLP)及免疫组化技术(IHC)，检测62例肺癌和34例肺部良性疾病患者痰标本中k-ras、p53基因的突变状况，检测结果与组织学、脱落细胞学诊断进行对比分析。结果肺癌痰标本的脱落细胞学敏感性为61%、阴性预计值(NPV)为59p53阳性表达的敏感性为77、NPV为66k-ras变异阳性的敏感性为34、NPV为42p53、k-ras和痰脱落细胞学联合检测：敏感性提高至92(P005)、NPV为84(P005)。痰的颜色24例痰细胞学假阴性痰标本中p53或k-ras变异阳性17例(71)。结论痰标本p53、k-ras的联合检测可增加痰检的敏感性，补充和提高脱落细胞学的诊断价值。痰细胞学检查是传统的早期发现肺癌的重要手段。这种建立在形态学基础上的判断，往往因痰标本中肿瘤细胞过少、组织变异和形态上的不典型增生而受到限制。肿瘤生物学基础研究的新发展，启发人们可以将癌基因突变或转位而产生的肿瘤专一性蛋白产物作为标志物，应用于临床检测。共有贴子数6篇一、肺部良性病变脱落细胞形态从肺内咳出的痰液须经过气管喉、咽、然后从口腔排出，故痰液成分实际上是上下呼吸道。口咖啡因及口腔等我们应用多聚合酶链反应(PCR)结合限制性长度片段多态性分析法(RFLP)以及免疫组化技术(IHC)，检测了96例痰标本中肺癌关联基因p53和k-ras的突变情况，旨在探讨痰液癌基因突变的检测在肺癌诊断中的可靠性以及癌前诊断的可行性。
材料与方法
1标本：96份痰标本取自我院1991年7月1997年4月住院和门诊病例，其中包括新鲜痰标本和石蜡痰块。96例病例中男59例女37例，年龄2884岁。所有病例均最后为组织学确诊，包括纤维支气管镜(纤支镜)手术、经皮肺穿刺及胸膜活组织检查(活检)。96例中肺癌62例(鳞癌28例腺癌22例，小细胞癌7例，鳞腺癌3例，其它类型2例)，肺部良性疾病34例，该34例痰标本作为实验的阴性对照。参加检测的痰标本中有79份在纤支镜后留痊占82。新鲜标本一式三份，一份做常规石蜡切片病理确诊、一份涂片免疫组化检查、另一份留置-70冰存，待提取DNA。
2k-ras突变检测：PCR-RFLP技术：(1)DNA提取：蜡块标本切片7m按组织块大小取35片至eppendof管常规脱蜡、脱水篇首1病历摘要患者肖,男汉族,71岁,因活动后气促伴双下肢浮肿2月,近期出现气促呼吸困难,咳嗽,咯黄色脓性痰5d,于2002年11月22日住入50烤箱干燥新鲜的痰标本加入糜蛋白酶混合消化后离心、去上清液、提取沉淀物约1030mg，加入裂解液200l，42保温过夜，本文继25种标准菌株形态学观察与菌体测量之后,对16例肺结核患者的痰直接涂片及其分离菌株涂片进行了观测。其中发现不少失去抗酸性菌体。G_(244)号标本培养菌株呈痰是怎么形成的次日酚/氯仿抽提，冷乙醇沉淀DNA离心后，沉淀物溶于40l双蒸水中备用。(2)PCR扩增：PCR扩增按Levi等1法并加以改进，引物由中国科学院上海细胞所合成摘要：根据痰液细胞图像的边缘灰度变化特点，在经典微分算子检测基础上，运用适当的改进的数学形态学方法对痰液细胞进行边缘提龋在实验中对同一幅痰液细胞图像分别ras试剂盒由北京医科大学分子病理学实验室提供，咳嗽有痰的偏方扩增产物为k-ras第12密码子扩增片段。步骤：每管混匀下列试剂三蒸水109l，PCR缓冲液25l含引物、dNTP和Tag酶的混合液约15l，使反应总体系为25l，20l石蜡油覆盖反应液轻混匀，进入PCR循环循环参数：94变性1分钟，55退火30秒钟，72延伸20秒，共30个周期。扩增产物与上样缓冲液(含溴酚蓝、聚蔗糖)混匀后，绿色的痰取10l行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪上若在156bp处出现特异放大带即为扩增的k-ras第12密码子。(3)酶切电泳：酶切反应体系包括PCR扩增产物缓冲液2l,BstNI核酸内切酶(中国医学科学院基础所提供)2U,60保温46小时。由于k-ras第12密码子上有BstNI限制性内切酶位点因此，利用相应的内切酶来消化扩增的DNA片段，野生型DNA片段由于存在内切酶位点而被切断，形成127长度的DNA片段，而突变型片段由于丧失了内切酶位点不被内切酶所消化，电泳结果仍为156bp长度DNA片段25%琼脂糖凝胶电泳中出现二种片段。
3p53突变检测-IHC：石蜡切片4m常规脱蜡脱水，文档标签患者(82451)成虫(2869)形态(22554)线虫(1615)重症(4678)评论评论的时候，请遵纪守法并注意语言文明，多给文档分享人一些支持。提交评论Ctrl+进行微波处理促进抗原显露，然后与新鲜痰标本一起行ABC法免疫组化检测。其中一抗为鼠抗人单克隆抗体(DO-7丹麦DAKO公司产品)，抗p533545位氨基酸对野生型、突变型p53均有反应。生物素化羊抗鼠二抗IgG和ABC试剂盒为美国VECTOR公司产品。免疫组化染色采用ABC法进行，具体染色步骤按试剂盒内使用说明进行。P53蛋白染色阳性细胞为核内染成棕黄色，阴性细胞核为蓝色，胞浆不着色。每批染色严格注意条件齐同，并设置对照，阴性对照以PBS代替一抗、二抗及ABC液。摘要观察痰瘀同治方对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉、心肌及内皮细胞形态学的影响。采用高脂饲料制造家兔动脉粥样硬化模型,再给痰瘀同治方大中、小剂量P53阳性对照选用已知阳性的标本。
4统计学分析：显著性检验用2检验或四格表确切概率法。
结果
一痰细胞学、分子学检测及诊断意义
1脱落细胞形态学阳性38例、阴性46例、核异质或癌疑(形态学不肯定)12例。对比组织学诊断结果：真阳性38例、假阳性0、真阴性34例、假阴性24例。
2p53突变检测：阳性55例、阴性41例。对比组织学诊断结果：真阳性48例、假阳性7例、真阴性27例、假阴性14例(图14)。
3k-ras突变的检测：阳性25例、阴性71例。对比组织学结果：真阳性21例、假阳性4例、真阴性30例、假阴性41例。联合检测：阳性61例、阴性35例。对比组织学结果：真阳性53例、假阳性8例、真阴性26例、假阴性9例。
5p53、k-ras突变细胞学联合检测：阳性65例、阴性31例。对比组织学结果：真阳性57例、假阳性8例、真阴性26例、假阴性5例。
痰液细胞学检测、p53、k-ras检测以及联合检测对肺癌的诊断价值见表1。结果显示：痰液分子标志物的检测可提高和补充脱落细胞学的诊断价值，敏感性由原来的61提高至92(2=1623，P005)，痰的形成阴性预计值(NPV)由原来的59提高至84(2=666，P005)。
表196例痰标本痰液细胞学、分子生物学以及联合检测价值的比较
